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　　免疫熒光技術是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。傳統實驗方法用小玻片，先泡酸、再晾干、再 coating、再種細胞、染色、封片成像。

　　本文章介紹新方法，我們將描述在通道載玻片內培養大鼠成纖維細胞（Rat1）的單個實驗案例。然后，我們用AlexaFluor®488鬼筆環肽染色F-肌動蛋白細胞骨架，并用DAPI對細胞核進行復染。

　　該實驗包括四個主要步驟：

　　實驗所需材料：

　　• HT1080細胞懸浮液（180μl；3x10⁵ 細胞/ml）

　　• 具有10% FCS的DMEM

　　• μ-Slide VI^0.4，ibiTreat底部處理（ibidi #80606）

　　• Dulbecco′s PBS

　　• PBS中3.7%多聚甲醛（PFA）

　　• 0.1% Triton® X-100

　　• PBS中的1% BSA

　　• Alexa Fluor® 488鬼筆苷（0.165 μM）

　　• DAPI（0.1 μg/ml）

　　• ibidi封片劑（ibidi #50001）

　　• 可選：ibidi浸漬油（ibidi #50101）

　　1、培養

　　• 在無菌條件下打開 μ-Slide VI ^0.4、ibiTreat (80606) 的包裝，并將其放在 μ-Slide 架 (80003) 上。

　　• 在每個通道中加入 30 μl 3x10⁵細胞/ml 大鼠成纖維細胞（Rat1）細胞懸液。如下圖所示或我們的網站上所示，直接將移液器加入通道。

　　• 用隨附的蓋子蓋住。

　　• 將載玻片放入培養箱 (37 °C; 5% CO2) 培養并讓細胞附著 (60 分鐘)。然后用 60 μl 無細胞培養基填充兩個通道口。

　　• 孵育過夜。

　　2、固定和透化

　　在固定和透化過程中要小心，通道永遠不要變干！通過用下一個沖洗剩余的溶液來交換通道中的液體

　　固定：

　　• 使用細胞培養抽吸裝置從所有通道口中吸出培養基。用 Dulbecco PBS 洗滌細胞，方法是將 200 μl 緩慢加入每個通道的一個空通道口，并從每個通道的相對通道口吸出。不要吸出整個通道體積。

　　• 用約 100 μl 3.7% 多聚甲醛的 PBS 固定細胞。20 分鐘后，通過用 200 μl PBS 填充一孔并從另一孔中吸出來沖洗通道內的液體；確保通道永不干涸。

　　透化和封閉：

　　• 如上所述，用 200 μl PBS 再次洗滌細胞。

　　• 在 PBS 中用 ~100 μl 0.1% Triton® X-100 3-5 分鐘。

　　• 用 PBS 洗滌細胞。

　　• 用 ~100 μl 封閉溶液（PBS 中的 1% BSA）20 分鐘。

　　• 用 PBS 洗滌細胞。

　　3、染色

　　• 使用抽吸裝置從通道中取出所有液體。不要讓通道變干。

　　• 吸液后立即加入 30 μl Alexa Fluor® 488 鬼筆環肽（在 200 μl PBS 和 1% BSA 中）。用 1 毫升注射器注射溶液會有所幫助。在室溫下孵育 20 分鐘。

　　• 用 PBS 洗滌細胞。

　　• 用 30 μl DAPI (0.1 μg/ml) 3-5 分鐘。

　　• 用 PBS 清洗細胞并應用 ibidi 封固培養基，直到通道被填滿（約 50 μl）。ibidi 封固劑以甘油為基礎，并含有用于抗褪色的 DABCO。載玻片可存放約4 周。

　　4、成像

　　在熒光顯微鏡下選擇適當的濾鏡，也可以使用浸油觀察細胞。

　　之所能如此簡便完成免疫熒光實驗，是因為這些ibidi培養皿和載玻片的底部為特殊處理的材質，絕大多數細胞可以直接貼壁生長，而不需要另外包被。同時，這些耗材的底部薄如蓋玻片，可以直接使用倒置顯微鏡進行觀察，得到高質量的成像，適用于顯微鏡比如共聚焦顯微鏡。

　　實驗例子

　　超分辨率顯微鏡 (STED)觀察肌動蛋白細胞骨架

　　μ-Slide VI ^0.4與超分辨率顯微鏡方法兼容，使用 LifeAct-TagGFP2 蛋白，可以詳細觀察肌動蛋白細胞骨架。在這個實驗中，固定的 Rat1 成纖維細胞與 LifeAct-TagGFP2 蛋白一起在 μ-Slide VI ^0.4，ibiTreat中孵育。并用 STED 顯微鏡以創建超分辨率圖像。

　　使用LifeAct-TagGFP2 蛋白對 Rat1 成纖維細胞中的肌動蛋白細胞骨架進行超分辨率顯微鏡檢查。使用 Plan-Neofluar 100x/1.4 物鏡在 STEDYCON 超分辨率 STED 納米顯微鏡系統（Abberior Instruments GmbH，德國哥廷根）上進行顯微鏡檢查。

　　μ-Slide VI ^0.4用于獲取人 BJ 成纖維細胞的共聚焦圖像。用 Drp-1 siRNA 轉染細胞并用 MitoTracker Red 染色以觀察融合的線粒體。

　　在 ibidi μ-Slide VI ^0.4中培養的人 BJ 成纖維細胞的共聚焦顯微鏡圖像。MitoTracker Red（紅色）用于可視化線粒體。圖片由土耳其伊斯坦布爾哈里克大學醫學院的 Fulya Dal Yontem 提供。

　　用于肌動蛋白可視化的熒光顯微鏡

　　在這個例子中，A549 細胞（肺泡上皮細胞）在 μ-Slide VI ^0.4，ibiTreat上培養，以研究促炎刺激對細胞骨架重排的影響。將細胞暴露于內毒素 (LPS) 中 4 小時，并用熒光鬼筆環肽染色以觀察細胞收縮和細胞間間隙的出現。

　　A549 細胞在 μ-Slide VI ^0.4、ibiTreat 上生長，暴露于內毒素 (LPS) 4 小時，并用熒光鬼筆環肽染色以檢測細胞肌動蛋白（紅色）。40 倍放大倍率。圖片由美國弗吉尼亞州里士滿弗吉尼亞聯邦大學的 Bernard Fisher 提供。